Microcefalia in vitro

Vírus zika se replica em células neurais graças a manipulações genéticas que interrompem desenvolvimento do cérebro.

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Células tronco neurais infectadas com ZikV isolado no Brasil. Azul: núcleos celulares. Verde: Nestina. Laranja: Zika vírus

Quando invade o cérebro, o vírus zika ocasiona alterações no funcionamento da maquinaria genética de maneira que as células nervosas deixam de se dividir e se diferenciar nos vários tipos que compõem o órgão responsável por comandar o funcionamento do corpo. Além disso, também ativam genes que ajudam o próprio vírus a se replicar. Dito assim pode parecer quase óbvio, mas chegar a essas conclusões envolveu uma conjunção de especialistas de diversas instituições brasileiras trabalhando com os mais atuais modelos e técnicas, como mostra artigo publicado em 23 de janeiro na revista Scientific Reports.

“Podemos investigar a ação do vírus em modelos com complexidade celular crescente”, conta o neurocientista Erick Loiola, pesquisador em pós-doutorado no Instituto D’Or de Pesquisa e Ensino (Idor), no Rio de Janeiro, e um dos autores do trabalho. Ele se refere ao cultivo bidimensional de células nervosas em placas, aos aglomerados de células conhecidos como neuroesferas e aos minicérebros, ou organoides cerebrais. Estes últimos são estruturas mais complexas que reproduzem características de um cérebro um pouco mais desenvolvido, como o de um feto aos 3 meses de gestação. Loiola faz parte do grupo liderado pelo neurocientista Stevens Rehen, professor da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) e diretor de pesquisa do Idor.

Desde 2009, pesquisadores liderados por Stevens Rehen estabeleceram linhagens de células-tronco de pluripotência induzidas (iPS), que podem gerar uma série de tecidos diferentes a partir de células adultas, na maior parte das vezes retiradas da pele. A partir daí, logo adquiriram a técnica para produzir as versões tridimensionais que servem de modelo para o estudo de vários aspectos do funcionamento e do desenvolvimento do cérebro, como no caso dos distúrbios psiquiátricos há anos estudados por Rehen.

Os minicérebros eram considerados modelos para estudo de microcefalia desde 2013, dois anos antes de o vírus zika ganhar fama mundial pela conexão com o nascimento de bebês com o cérebro menor do que o esperado para a idade gestacional e outros danos neurológicos. E já eram produzidos no Idor, assim como as neuroesferas. Isso pôs o laboratório em posição privilegiada para fazer frente à epidemia e testar os efeitos do vírus. No ano passado, o grupo indicou que as neuroesferas infectadas pela linhagem africana do vírus zika se degradam e que células infectadas têm dificuldade em formar os aglomerados.

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Aqui núcleos celulares em amarelo e vírus zika em rosa

DNA manipulado

Agora foi a vez de examinar com maior precisão o que acontece no desenvolvimento das células infectadas pela linhagem viral em circulação no Brasil, isolada de um paciente do Espírito Santo, e do ponto de vista da sala de comando – os genes. Isso foi possível analisando o RNA e seus produtos – as proteínas – encontrados nas células, como indicação da atividade genética. “Analisamos as neuroesferas logo no início de seu desenvolvimento, antes que as células começassem a morrer”, explica a bióloga Juliana Minardi, que faz estágio de pós-doutorado no Laboratório de Neuroproteômica da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), coordenado pelo biólogo Daniel Martins-de-Souza. 

Eles já trabalhavam em parceria com o Idor em um projeto sobre esquizofrenia, então foi simples aplicar o mesmo modelo à infecção por zika.

A ideia era justamente investigar o que causava a deficiência já observada no desenvolvimento das neuroesferas, quando as células progenitoras se diferenciam em neurônios e células da glia (que formam a estrutura do cérebro). Ao analisar a diferença entre células infectadas e sadias logo nos primeiros dias, eles detectaram alterações na produção de cerca de 500 proteínas – um amplo repertório para causar alterações em uma gama de funções celulares. Depois de identificá-las com base em estudos anteriores, ficou claro que o zika cria um ambiente de instabilidade que turbina a produção de proteínas ligadas ao reparo de DNA. Na prática, porém, essas proteínas acabam inibindo a produção de moléculas associadas à proliferação e à diferenciação das células neurais e replicando o material genético do vírus. O resultado são neuroesferas mais escassas, mirradas e malformadas. “O ambiente promovido pelo vírus nas neuroesferas leva suas células a interromper seu ciclo normal de vida, incluindo sua diferenciação em neurônios”, conclui Martins-de-Souza.

Para os pesquisadores da Unicamp, esse tipo de olhar detalhado pode ajudar a identificar alvos interessantes de medicamentos que já estão em teste para outras doenças, além de outros ainda não descobertos. Um exemplo de drogas já conhecidas é a cloroquina, usada há décadas contra malária, e que em testes com células neurais humanas e neuroesferas de camundongo se mostrou capaz de inibir a proliferação do vírus e a morte de células, de acordo com estudo coordenado pelo virologista Amilcar Tanuri, da UFRJ, em parceria com o grupo de Rehen e publicado em dezembro na revista Viruses. Outra parceria avaliou o antiviral sofosbuvir, normalmente usado contra a hepatite C, que revelou efeito protetor em minicérebros em estudo liderado pelo biólogo Thiago Moreno Souza, da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) do Rio de Janeiro, publicado em 18 de janeiro na Scientific Reports. Loiola, também coautor desse artigo, considera os resultados altamente promissores, embora nem todos os países tenham aprovado o sofosbuvir para uso em grávidas, cujos fetos são as maiores vítimas do risco de microcefalia. “O laboratório está pronto para oferecer os três modelos neurais, que variam em complexidade e velocidade de resposta, para uso como plataforma de teste de drogas”, afirma.

Projeto

Desenvolvimento de um teste preditivo para medicação bem sucedida e compreensão das bases moleculares da esquizofrenia através da proteômica (nº 2013/08711-3); Modalidade Jovens Pesquisadores em Centros Emergentes; Pesquisador responsável Daniel Martins de Souza (Unicamp); Investimento R$ 1.794.423,85.

Artigos científicos

GARCEZ, P. P. et al. Zika virus disrupts molecular fingerprinting of human neurospheres. Scientific Reports. v. 7, n. 40780. 23 jan. 2017.

SACRAMENTO, C. Q. et al. The clinically approved antiviral drug sofosbuvir inhibits Zika virus replication. Scientific Reports. v. 7, n. 40920. 18 jan. 2017.

DELVECCHIO, R. et al. Chloroquine, an endocytosis blocking agent, inhibits Zika virus infection in different cell models. Viruses. v. 8, n. 12, p. 322. dez. 2016.

Fonte: Revista Fapesp on line jan/2017

Por: Maria Guimarães 

Confirmado caso de bebê sem microcefalia com lesão cerebral e ocular causada por zika

Em texto publicado na revista The Lancet, pesquisadores brasileiros afirmam que vírus pode causar uma síndrome congênita de amplo espectro, que pode ou não incluir microcefalia

© WIKIMEDIA COMMONS

Em texto divulgado nesta quinta-feira (07/06) na revista The Lancet, pesquisadores brasileiros descreveram o caso de um bebê nascido sem microcefalia, mas com lesões severas no cérebro e na retina causadas pelo vírus zika.

A pesquisa foi realizada por cientistas da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) e da Fundação Altino Ventura, de Pernambuco – entidade filantrópica que presta assistência oftalmológica à população carente do Estado considerado como o epicentro da epidemia de zika.

O grupo avaliou o caso de uma criança que nasceu com 38 semanas de gestação, 3,5 quilos e perímetro cefálico medindo 33 centímetros – valor considerado normal para a idade. No momento do exame, o bebê tinha 57 dias.

“O menino nasceu aparentemente normal e, como não tinha microcefalia, os pais o levaram para casa. Após alguns dias, começou a ter convulsão. Voltou para o hospital e foi detectada calcificação cerebral, além de aumento dos ventrículos e lesão grave na retina, semelhante aquelas encontradas em bebês com microcefalia”, contou Rubens Belfort, professor da Escola Paulista de Medicina, da Unifesp, e coautor do estudo.

A mãe não apresentou sintomas da doença durante a gravidez, mas, após serem descartadas outras infecções associadas a malformações congênitas, um exame do líquor da criança mostrou a existência de anticorpos contra o zika.

Segundo Belfort, as manifestações observadas nesse caso se enquadram no que vem sendo chamado de Síndrome Congênita do Zika, que tem um amplo espectro e diferentes manifestações. Pode ou não incluir microcefalia, bem como lesões cerebrais, oculares, auditivas, espasmos e convulsões.

“Não dá para excluir a infecção pelo zika só porque a microcefalia não está presente. A microcefalia é um fator de risco para a presença de lesões cerebrais e oculares, mas não é uma pré-condição absoluta. Por isso é necessário testar as mães para o zika durante o pré-natal e, quando der positivo, acompanhar as crianças após o nascimento e fazer a oftalmoscopia”, disse Belfort.

Considerada um exame simples de ser feito, a oftalmoscopia permite visualizar as estruturas do fundo de olho, como o nervo óptico, os vasos retinianos, e a região central da retina denominada mácula.

Segundo o pesquisador, há outros casos semelhantes sendo avaliados e devem ser confirmados em breve. “Resolvemos já divulgar este primeiro para a informação científica circular mais rápido”, contou.

Fatores de risco

No início de 2016, o mesmo grupo de pesquisadores mostrou pela primeira vez, em artigo publicado na revista The Lancet, que, além de microcefalia, a infecção pelo vírus zika durante a gestação pode causar atrofia na retina e até mesmo cegueira nos recém-nascidos.

Em maio, em artigo publicado na revista JAMA Ophthalmology, revelaram que a probabilidade de ocorrer lesões oftalmológicas graves é maior em filhos de mães que relataram sintomas da doença no primeiro trimestre de gestação. Ainda segundo o estudo, quanto menor for o perímetro cefálico do recém-nascido, maiores as chances de problemas na retina.

“É comum a ocorrência de cegueira entre bebês com microcefalia, mas as lesões encontradas nos filhos de mulheres que relataram sintomas de zika durante a gestação são diferentes e bem específicas. Mas ainda havia dúvida se, de fato, o problema teria sido causado pelo vírus. Neste estudo, nós excluímos as outras possíveis causas de cegueira”, contou Belfort.

A pesquisa foi feita com 40 crianças microcefálicas nascidas de mães que contraíram zika durante a gravidez. Os bebês tinham entre um e sete meses de idade na época da avaliação e foram divididos em dois grupos: com e sem alterações detectadas na oftalmoscopia.

Todos os bebês passaram por exames para descartar doenças causadoras de cegueira congênita, como rubéola, herpes, toxoplasmose, sífilis, citomegalovírus e HIV/Aids.

O teste capaz de detectar a presença de anticorpos contra o vírus zika no líquor foi aplicado em 24 dos 40 bebês incluídos na pesquisa e todos apresentaram resultado positivo. Belfort explicou que o método diagnóstico não foi aplicado em todos os participantes porque ainda não estava disponível quando a avaliação começou.

O índice de positivo para o zika foi de 63,6% no grupo com alterações na retina e de 55% no grupo sem alteração oftalmológica (o índice provavelmente seria maior se todas tivessem feito o teste sorológico). “Os dados deixam claro que a infecção pelo vírus zika leva à microcefalia e à cegueira em grande parte das crianças”, disse o pesquisador.

Todas as mães dos bebês participantes responderam a um questionário em que relataram os principais sintomas vivenciados na gestação. O mais frequente nos dois grupos foi erupção cutânea (65%), seguido por febre (22,5%), dor de cabeça (22,5%) e dor nas articulações (20%). Nenhuma delas relatou conjuntivite ou outros sintomas oculares.

Mais de 70% das mães de crianças com problemas oftalmológicos afirmaram ter apresentado os sintomas no primeiro trimestre de gestação.

“Observamos que as lesões na retina eram mais graves nos filhos de mães que se infectaram no primeiro trimestre – grande parte da retina era inexistente nesses casos. Nossa hipótese é que, assim como ocorre no cérebro, o vírus não deixa parte da retina se desenvolver”, disse Belfort.

Com o intuito de ampliar o entendimento sobre os danos causados pela infecção, os pesquisadores continuam acompanhando as crianças de Pernambuco e também um grupo de bebês da Bahia. Além disso, estão sendo estudadas as placentas das mães que deram à luz filhos com microcefalia.

Artigos científicos

FREITAS, B. P. et al. Ocular Findings in Infants With Microcephaly Associated With Presumed Zika Virus Congenital Infection in Salvador, Brazil. JAMA Ophthalmology. vol 134, n. 05. mai 2016.

VENTURA, C. et al. Zika: neurological and ocular findings in infant without microcephaly. The Lancet. on-line 07 jun. 2016.

Fonte: Revista Fapesp on line  junho/2016

Por Karina Toledo